Développement de nouveaux bio-essais et biocapteurs à base d’aptamères et application en diagnostic médical

Abstract

Les biomarqueurs sont des molécules synthétisées au sein de l’organisme dont leurs quantifications, dans une matrice biologique (sang, sérum …),permettent le suivie de plusieurs maladies ainsi que la réponse au traitement. Le défi actuel est de développer de nouveaux dispositifs capables de détecter ces marqueurs à des stades précoces. Parmi ces dispositifs, les biocapteurs ont révolutionné le domaine d’analyse grâce à leurs caractéristiques très intéressantes ; le faible coût, la simplicité et la sensibilité. Dans le but d’assurer un diagnostic précis, rapide et sensible des maladies, plusieurs méthodes analytiques ont été développées dans ce travail. On s’est intéressés dans une première partie du travail au développement d’un aptacapteur fluorescent sensible et sélectif pour la quantification de la dopamine. Ce système de détection est basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) en utilisant un aptamère à ADN marqué par lacarboxyfluorescéine (FAM).L’oxyde de graphène « quencher » a été utilisé comme accepteur d'énergie, et l’aptamère marqué à laFAM comme donneur. La plateforme de détection développée a montré une bonne performance analytique dans une gamme de concentrations de 3 à 1680 nM, avec une limite de détection de 0,031 nM. Une excellente sélectivité envers la cible par rapport à d’autres molécules interférentes a été également démontrée avec une applicabilité satisfaisante dans des échantillons de sérum humain. Ensuite, nous avons élaboré un aptacapteur électrochimique sans marquage pour la quantification de l'hémoglobine. Des nanoparticules d’or ont été déposées électrochimiquement sur des électrodes de carbone sérigraphiées. La surface modifiée a été incubée avec la L-cystéine et utilisée pour immobiliser l’aptamère. Cet aptacapteur a montré une bonne sélectivité avec une gamme linéaire allant de 50 ng.ml-1 jusqu’à 36 000 ng.ml-1 et une limite de détection de 1,2ng.ml-1. Après la fixation de l'Hb sur la surface fonctionnalisée, l'activité peroxydase de cette dernière a été exploitée pour la quantification de H2O2 et de nitrite. Les mesures ampérométriques ont montré de larges gammes linéaires ; 0,2 µM –7,7 mM et 3,6 nM - 1,3 mM pour H2O2 et nitrite, respectivement, avec des limites de détection de 0,044 µM et 0,55nM. De plus, l'excellente applicabilité du système de détection a été démontrée dans des échantillons réels (sang humain, eau de rivière, eau de pluie). Finalement, un troisième aptacapteur colorimétrique utilisant la BSA comme support d’immobilisation a été mis au point pour la quantification de l’hémoglobine. Les conditions expérimentales ont été optimisées en utilisant la méthodologie des surfaces de réponse ainsi qu’un réseau de neurones artificiels couplé à un algorithme PSO. Les paramètres optimaux déterminés ont permis d’obtenir une gamme de détection allant de 4 à 10 mg.ml-1 avec une limite de détection de 0,044 mg.ml-1.